线粒体病是一类重要的遗传代谢病，其发病可覆盖全年龄段，尤其是儿童线粒体病致死致残率极高。随着生物化学及分子与细胞生物学技术的发展，线粒体病的实验室诊断经历了快速的发展，相关诊断路径和策略也从高度有创的实验室检测逐渐过渡到以无创筛查为主。但是，线粒体病实验室诊断仍然存在单一检测策略的阳性诊断率不足、实验室漏检与待排查比例居高不下的困扰，因此新的线粒体病检测技术被开发并用于协助疾病的诊断。该文从基因、酶生物化学与代谢生物学3个层面对当前线粒体病实验室诊断的进展进行综述，旨在为特定场景下线粒体病实验室诊断策略选择提供参考，也为后续检测技术的研发提供一些建议。