目的基于超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）技术，建立同时检测血清叶酸及代谢物5-甲基四氢叶酸、甲酰四氢叶酸和甲氨蝶呤浓度的分析方法。方法通过固相萃取将样品中目标分析物浓缩富集，经Acquity UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm,1.8 μm）分离，以0.1%甲酸水和乙腈为流动相进行梯度洗脱，使用超高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪（UPLC I-Class Xevo TQ-S micro IVD）建立检测方法，并依据CLSI C62-A等文件对该方法的定量限、线性范围、精密度、准确度、稀释效应、携带污染以及特异度和干扰试验等进行性能评价。结果该方法中叶酸检测定量限为1 ng/mL，5-甲基四氢叶酸、甲酰四氢叶酸和甲氨蝶呤定量限为5 ng/mL。叶酸在1~2 00 ng/mL质量浓度范围内线性关系良好（R 2＞0.99），5-甲基四氢叶酸、甲酰四氢叶酸和甲氨蝶呤线性范围为5~2 000 ng/mL（R 2＞0.99）。4种目标分析物日内精密度为1.7%~13.9%，日间精密度为2.7%~14.6%，样品加标回收率为93.6%~108.9%，精密度和准确度良好。稀释效应、携带污染以及特异度等其他考察结果均符合评价要求。结论建立了一种准确高效的UPLC-MS/MS方法，一针进样可以同时完成血清中叶酸及代谢物和甲氨蝶呤血药浓度的检测。该方法不仅帮助临床实现了对甲氨蝶呤血药浓度和解救药物甲酰四氢叶酸钙浓度的同步监测，还可动态观察治疗过程中患者体内总叶酸和活性叶酸的水平变化，为制订合理的甲酰四氢叶酸钙解救方案，进一步提升甲氨蝶呤治疗的安全性和有效性奠定了基础。