目的整合规律成簇间隔短回文重复（CRISPR）序列与其相关效应蛋白（Cas）检测系统、重组酶聚合酶扩增（RPA），构建针对结核分枝杆菌利福平耐药相关rpoB基因突变的快速检测方法。方法通过文献分析确定rpoB基因中的高频突变位点D516Y（GAC→TAC）、H526D（CAC→GAC）和S531L（TCG→TTG）为检测靶标，构建野生型和突变型质粒。设计并筛选RPA等温扩增引物，以及靶向突变位点的CRISPR-RNA（crRNA），优化LbaCas12a蛋白浓度及反应条件，验证其反式切割活性和特异性；整合RPA扩增与CRISPR检测，优化扩增时间、模板量，通过荧光信号差异区分野生型与突变型质粒，进一步利用扩增管的物理结构建立单管RPA-CRISPR检测系统，改善检测性能。收集结核病患者的临床分离菌株，利用RPA-CRISPR反应体系进行rpoB目标突变位点检测。结果利用BLAST及Oligo calc寡核苷酸属性计算器等在线工具、2%琼脂糖凝胶电泳筛选出特异性引物F2/R7（扩增子289 bp）建立RPA扩增体系。针对3个目标突变位点，分别设计了包含23 nt间隔序列的516-TAC-crRNA、22 nt间隔序列的526-GAC-crRNA及23 nt间隔序列的531-TTG-crRNA，优化CRISPR-Cas12a体系，证实其反式切割活性及突变识别特异性（P<0.05），确定Cas12a/crRNA浓度组合为150/100 nmol/L（516位点）和200/50 nmol/L（526/531位点），3个检测体系中的荧光报告基团浓度均为250 nmol/L。RPA-CRISPR检测系统的最佳反应条件为RPA等温扩增时间为20 min，DNA模板及扩增产物加样量均为5 μL。利用扩增管的物理结构建立单管RPA-CRISPR检测系统，其能够在42 ℃ 30 min内完成检测，并且检测3种突变型质粒灵敏度均为10 5 copies/μL。单管RPA-CRISPR方法对25例临床分离菌株进行检测，结果检测到2例rpoB_D516Y突变、1例rpoB_H526D突变和8例rpoB_S531L突变，与全基因组测序（WGS）符合率达96%。结论单管RPA-CRISPR方法有效避免了气溶胶污染，具有操作简便、快速高效的特点，为资源有限条件下的结核分枝杆菌利福平耐药性检测提供了可能性。